DIAG4ZOO

Depuis de nombreuses années, Diag4Zoo identifie et analyse des biomarqueurs en santé animale et développe des diagnostics innovants en partenariat avec les acteurs du monde de la mer.

Ces diagnostics ont pour but d’être utilisés comme routine en aquaculture afin d’améliorer le suivi sanitaire des animaux, la qualité des élevages et optimiser les productions : détection précoce de pathogènes, sélection d’individus d’intérêt et de géniteurs résistants, utilisation ciblée d’antibiotiques, évaluation et contrôle des milieux de cultures en circuits fermés ou libres (microbiomes) et surveillance sanitaire de ces circuits. Ces tests permettent d’optimiser les démarches de biosécurité sur les productions aquacoles : poissons, coquillages, crustacés …

Ces diagnostics sont basés sur l’identification en amont de marqueurs biologiques de type ADN ou ARN et sont utilisables sur des automates existants (PCR, PCR en temps réel) ou directement sur le terrain (test bandelette).

L’expertise de l’équipe scientifique de Diag4Zoo dans l’identification de biomarqueurs n’est pas dépendante de l’espèce animale. Ainsi, son savoir-faire dans le design de tests (PCR ou de terrain) est applicable à n’importe quelle espèce marine et pour de nombreuses applications.

L’équipe de Diag4Zoo a ainsi travaillé en santé animale sur les poissons, les huitres, les crevettes et certains mollusques dans le domaine de la sécurité alimentaire (veille sanitaire), dans celui de l’agro-alimentaire, dans le domaine de l’environnement (évaluation de l’impact de pesticides ou herbicides dans le milieu marin) mais aussi dans le développement de nouveaux principes actifs.

Ces travaux sont généralement le fruit de collaborations avec des équipes académiques et privées, notamment avec des partenaires en Occitanie : IFREMER, CIRAD, Cepralmar (Centre d’étude pour la promotion des activités lagunaires et maritimes), CRCM (Comité Régional de Conchyliculture de Méditerranée), Groupe BARBA (spécialiste de la transformation des produits de la mer) …

Poissons : bar / daurade / truite / thon / espadon

Détection de Virus

L’équipe de Diag4Zoo a mis au point un test de détection du Nodavirus [lien vers page nodavirus], virus qui peut toucher différents types de poissons d’élevage : bar, daurade, mérou…

Le kit de détection ou le service d’analyse proposé sont basés sur l’amplification enzymatique d’une séquence spécifique de nodavirus par PCR. Cette technologie est très sensible et permet d’obtenir un résultat en moins de 4h.

Identification de Biomarqueurs

L’équipe de Diag4Zoo a également réalisé des études chez la truite qui ont permis d’identifier des Biomarqueurs corrélés à l’alimentation et à l’environnement de l’animal.

Identification d’espèce

Diag4Zoo a mis au point une méthode innovante pour identifier les espèces de thon, à partir de prélèvements de chair (longe, steak…), en utilisant une région riche en SNP du gène ND4 de l’ADN mitochondrial (ADNmt).

Cette approche de génotypage (amplification PCR + séquençage) permet de fournir un résultat très rapide et de différencier avec précision des espèces économiquement importantes et différentes telles que le Thon Albacore (T. albacares), le Thon obèse (T. obesus) ou le Thon Rouge de l’Atlantique (T. Thynnus).

Ce service d’identification des espèces de thon est proposé aujourd’hui aux professionnels de la filière.

Suite à la demande d’un de ses partenaires industriels, Diag4Zoo aussi réalisé la mise au point d’un test d’identification et de traçabilité de l’espadon (Xiphias gladius).

A partir de bases de données génomiques et de ses outils, les scientifiques de la société ont identifié deux régions spécifiques du génome de l’espadon, et ont ainsi pu designer une technique d’identification génétique de l’espadon afin d’assurer sa traçabilité. La méthodologie utilisée repose sur le principe du DNA Barcoding (mise au point par Hebert et al., 2009) qui constitue à ce jour la méthode de référence dans l’identification d’espèce.

De manière générale, l’utilisation de méthodes de traçabilité génétique pour identifier certaines espèces peut être essentielle aux professionnels de l’agroalimentaire et de la distribution afin de pouvoir réaliser des contrôles de la qualité des produits achetés.

Grâce aux compétences techniques et au savoir-faire de DIAG4ZOO dans la mise au point rapide de nouvelles méthodes de traçabilité génétique, les professionnels bénéficient ainsi d’une expertise technique appliquée au vétérinaire pour valider leurs étiquetages et assurer la traçabilité des produits livrés par leurs fournisseurs.

Huître de Méditerranée

Huître de Méditerranée

Diag4Zoo a collaboré avec l’Ifremer (Montpellier), le Cepralmar (centre d’études et de promotion des activités lagunaires et maritimes), et le CRCM (Comité Régional Conchylicole de Méditerranée) sur l’identification et la sélection d’huîtres de Méditerranée résistantes aux pathogènes et aux mortalités estivales.

Les travaux se sont portés sur les mécanismes moléculaires et les bases génétiques impliquées dans la survie des huîtres Crassostrea gigas à des infections par des Vibrio virulents, tels que V. splendidus LGP32 et V. aestuarianus 02/41 Lpi. Ces infections ont été observées fréquemment dans les élevages et ont entraîné des mortalités importantes dans les productions d’huîtres de Méditerranée.

Grâce à des technologies haut-débit en génomique et transcriptomique, et sur la base d’expériences reproductibles et standardisées en laboratoire, les analyses ont conduit à la mise en évidence d’une combinaison de marqueurs biologiques qui pourrait prédire la capacité des huîtres à survivre à des infections par vibrio.

Cette combinaison de marqueurs biologiques, établie dans une première étape sur la base d’expériences en laboratoire, a été validée ensuite dans une seconde étape à partir d’analyses réalisées sur des huîtres présentes dans le milieu naturel. Cette combinaison de marqueurs biologiques a ainsi permis de distinguer les huîtres capables de survivre à des épisodes de mortalités importantes dans l’Etang de Thau à celles qui vont mourir, et ce avec 73% de fiabilité.

Par ailleurs, une deuxième étude a été réalisée pour étudier la capacité des huîtres à transmettre à leurs descendances ces marqueurs de survie, ces traits génétiques conférant de meilleures capacités de survie à des infections par Vibrio.

Cette approche de sélection par l’identification de marqueurs biologiques pourrait être appliquée pour produire des « lignées » d’huîtres adaptées aux différentes conditions environnementales et/ou résistantes à différents pathogènes. Ainsi, la production de souches locales adaptées aux conditions environnementales spécifiques aux différentes zones ostréicoles pourrait permettre de réduire les risques zoosanitaires et les conditions de stress des huîtres.

Dans le contexte de mortalités induisant des pertes économiques importantes, les professionnels pourraient ainsi produire des huîtres résistances à certaines infections et adaptées à certaines conditions environnementales. Ces nouvelles pratiques permettraient in fine de sécuriser la filière conchylicole.

Huître perlière de Polynésie française

La perliculture est une importante activité aquacole française. Elle est la seconde ressource à l’exportation de la Polynésie Française, après le tourisme.

Diag4Zoo a collaboré avec Ifremer (Tahiti) et différents acteurs impliqués dans la perliculture pour mener des recherches afin d’améliorer la qualité de la perle.

Les travaux ont porté sur :

  • la sélection de lignées d’huîtres perlières performantes, ce qui suppose la maîtrise de la reproduction et le contrôle des croisements,
  • la connaissance du déterminisme génétique de la couleur des perles et la compréhension des mécanismes conduisant à l’apparition des défauts de surface des perles.

Le succès évolutif des mollusques peut être attribué en partie à leur efficacité à soutenir et à protéger leur corps mou par une structure externe bio-minéralisée, la coquille. Les connaissances sur l’ensemble des protéines responsables de la formation du polymorphisme microstructural de la coquille et de ses propriétés uniques restent très fragmentaires.

L’équipe scientifique de Diag4Zoo a ainsi travaillé sur les différents répertoires sécrétoires qui contrôlent les processus de biominéralisation du prisme et du dépôt de nacre de la coquille de l’huître perlière.

Chez les huîtres Pinctada margaritifera et Pinctada maxima, 80 protéines matricielles de la coquille ont pu être identifiés, dont 66 sont entièrement uniques. Il s’agit de la seule description de l’ensemble de la “boîte à outils de biominéralisation” des matrices qui est censée réguler la formation des couches prismatiques et nacrées de la coquille dans les huîtres perlières. Ces travaux ont permis de démontrer que les prismes et la nacre sont assemblés à partir de répertoires protéiques très différents, ce qui suggère que ces couches ne dérivent pas l’une de l’autre.

La coquille de l’huître perlière Pinctada margaritifera est composée d’une matrice organique qui joue un rôle clé dans le processus dynamique de biominéralisation biologiquement contrôlée. Pour mieux comprendre ce processus, des analyses du transcriptome et du protéome du manteau et de la coquille calcifiants de Pinctada margaritifera ont été réalisés.

Pour augmenter le catalogue des données génomiques et identifier les protéines de la matrice de la coquille impliquées dans la biominéralisation chez P. margaritifera, certaines fractions du génome (de l’huître ont été séquencés (Expressed Sequence Tag, EST) correspondant au tissu calcifiant du manteau. Ces données ont ensuite été combinées à une analyse protéomique de la coquille.

Ces analyses ont permis de couvrir la majeure partie de la diversité des protéines matricielles de la coquille de P. margaritifera, mais aussi que les transcrits du manteau de l’huître codent pour des protéines présentes dans sa coquille, démontrant ainsi leur implication dans la formation de la coquille.

La combinaison des approches transcriptomiques et protéomiques est donc un moyen puissant d’identifier les protéines impliquées dans la biominéralisation. Les données générées dans cette étude ont fourni une liste très complète de séquences liées à la biominéralisation, et ont permis une avancée majeure dans le domaine de la biominéralisation des mollusques.

Crevette

Crevette

Identification de Biomarqueurs

L’équipe de Diag4Zoo a collaboré avec Ifremer (Montpellier) afin de mettre en évidence des marqueurs biologiques liés à la capacité des crevettes à survivre aux infections à vibrio.

La compréhension des mécanismes de défense antimicrobienne des crevettes permettrait ainsi d’aider à la conception de stratégies efficaces pour la gestion et le contrôle des maladies en aquaculture.

Dans cette étude, des analyses transcriptomiques des hémocytes circulants des peptides antimicrobiens (AMP) ont été réalisés. Il a été mis en évidence une relation entre le niveau d’expression de certains peptides antimicrobiens et la réponse positive de la crevette Litopenaeus stylirostris pour résister à une infection pathogène par Vibrio penaeicida. Des différences significatives de certains peptides antimicrobiens ont notamment été mises en évidence entre des crevettes non sélectionnées et la troisième génération d’une lignée de crevettes sélectionnées suivant leur capacité à survivre à des infections par Vibrio penaeicida.

Microbiome / Microbiote

La technologie Biofloc (BFT) est une méthode d’élevage nécessitant peu ou pas d’échange d’eau. Elle est très utilisée en aquaculture, et notamment dans la production de crevettes. Dans la colonne d’eau, ces systèmes développent des conglomérats de microbes, d’algues et de protozoaires, ainsi que des détritus et des particules organiques mortes. La communauté microbienne présente dans ces systèmes peut être utilisée comme système de traitement de l’eau des bassins, et les protéines microbiennes peuvent servir d’additif alimentaire.

Le problème actuel de la technologie Biofloc est la difficulté de contrôler la composition de sa communauté bactérienne pour obtenir une qualité d’eau optimale et garantir la santé des crevettes.

L’objectif de l’étude à laquelle a participé l’équipe scientifique de Diag4Zoo était d’étudier par séquençage la diversité microbienne (ou microbiome) présente d’une part, dans des prélèvements d’eau issus de deux environnements de culture (Biofloc et eau de mer) et, d’autre part, dans les intestins de crevettes élevées dans les deux environnements.

Les analyses de la communauté bactérienne identifiée dans les eaux des deux environnements, système BFT et “eau de mer claire”, contenant la crevette Litopenaeus stylirostris, ont révélé de grandes différences dans la distribution de fréquence des unités taxonomiques opérationnelles (OTU). Quatre des cinq communautés bactériennes les plus dominantes étaient différentes dans les deux environnements de culture. Les bactéries trouvées en grande abondance dans les BFT présentent deux caractéristiques principales : la nécessité d’un substrat organique ou de sources d’azote pour se développer et la capacité de s’attacher aux surfaces et de s’agréger. Une corrélation a été trouvée entre les groupes de bactéries et les paramètres physicochimiques et biologiques mesurés dans les bassins d’élevage. De plus, les communautés bactériennes des eaux d’élevage ont influencé le microbiote des crevettes. En effet, l’environnement biofloc a modifié le microbiote intestinal des crevettes, comme le montre le faible niveau (27 %) de similarité entre les communautés bactériennes intestinales dans les deux environnements.

Cette étude a fourni les premières informations décrivant la communauté microbienne complexe du système biofloc, et pourrait aider à comprendre la relation environnement-microbiote-hôte dans ce système d’élevage.

Ces interactions sont appliquées à la recherche sur l’immunité, la résistance aux maladies et la nutrition des crevettes d’élevage.

Par ailleurs, l’équipe de Diag4Zoo utilise également le séquençage et des traitements bioinformatiques spécifiques pour identifier et suivre des marqueurs spécifiques du microbiote intestinal en lien avec la réponse immunitaire ou la résistance des animaux face à certaines pathologies ou infections.

Deux approches techniques sont utilisées pour analyser le microbiote intestinal :

  • le séquençage du gène de l’ARN ribosomique 16S,
  • l’analyse de tous les gènes bactériens par métagénomique quantitative.

Mollusques : concombre de mer, cône marin

Concombre de mer

L’équipe de Diag4Zoo réalise régulièrement des analyses pour détecter la présence du Nodavirus chez les animaux marins, et notamment les concombres de mer « Holothuria tubulosa ». La recherche du virus s’effectue par qPCR sur des échantillons de gonades : la technologie utilisée est très sensible et permet d’obtenir une réponse et un résultat en moins de 4 heures.

Cône marin

Le cône marin est une sorte d’escargot de mer, un mollusque gastéropode prédateur qui possède un des venins les plus redoutables du monde marin. Ce venin du cône marin contient un mélange complexe de peptides bioactifs pour maîtriser les proies de l’animal.

L’équipe scientifique de Diag4Zoo a participé une étude internationale utilisant une combinaison d’approches protéomique et transcriptomique pour découvrir un ensemble de conopeptides et de conoprotéines présents dans le venin injectable de Conus consors, un escargot conique indo-pacifique chasseur de poissons.

A partir d’un vaste ensemble de séquences d’ARNm transcriptomiques de la glande à venin identifiés au cours de cette étude, 105 composants ont été isolés sur les quelques 400 masses moléculaires détectées dans le venin. Parmi ces composants, de nouvelles conotoxines ont été identifiées et décrites, ainsi qu’une nouvelle famille de conopeptides sans disulfure. Ces résultats fournissent l’aperçu protéomique le plus exhaustif et le plus précis à ce jour d’un venin d’escargot à cône injectable, et délimitent les principales familles de protéines présentes dans le venin administré.

Cette étude démontre la faisabilité de cette approche analytique et ouvre la voie à des stratégies de découverte de nouvelles molécules thérapeutiques grâce à l’utilisation de la transcriptomique chez l’animal.